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T4 DNA Ligase(T4連接酶)

簡要描述:

T4 DNA Ligase(T4連接酶)公司正在出售的產品:大鼠胰島瘤細胞 γ-谷氨酰基環轉移封閉多肽 支氣管敗血波氏桿菌PCR檢測試劑盒 大鼠膜聯蛋白Ⅴ(ANX-Ⅴ)ELISA試劑盒 谷胱S轉移(GST)活性比色法檢測試劑盒 熱陽光南極桿菌 胱抑9/半胱氨蛋白抑制劑9抗體

更新時間:2024-01-12

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T4 DNA Ligase(T4連接酶)

公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

貨號

產品名稱

規格

A-Hc2231

T4 DNA LigaseT4連接酶)

500U

濃    度: 5U/μl
產品概述:
在有Mg2+和ATP存在的條件下,T4 DNA Ligase能催化雙鏈 DNA或RNA上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接,還可以修復雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻,但不能催化單鏈 DNA 之間的連接。
保存條件:-20℃保存。
酶儲存緩沖液:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ,50mM KCl,1mM DTT, 0.1mM EDTA,50% (v/v) glycerol。
5 × T4 DNA Ligase Buffer
250 mMTris-HCl (pH 7.5), 50mM MgCl2,50mM DTT, 5mM ATP,連接促進劑。
來     源:純化于攜帶T4 DNA ligase 基因 的E. coli 菌株。
抑制劑和熱失活:
大于200mM的NaCl或KCl可以強烈抑制連接酶活性。65℃加熱 10分鐘或70℃加熱5分鐘即可失活。
單位定義:
在37℃,20分鐘內交換1 nmole 的32PPi所需要的酶量定義為一個Weiss單位。本產品酶1U(Weiss Unit)相當于200個粘性末端單位。在T4 DNA 連接酶反應緩沖液中,16℃條件下,30分鐘能夠使50%的經Hind III消化的λDNA 片段連接所需要的酶量為一個粘性末端單位。
質量控制:
藍白斑分析實驗表明白斑數小于2%;過量T4 DNA Ligase 混合超螺旋質粒檢測實驗表明無核酸酶檢出;SDS-PAGE檢測重組蛋白純度大于99%。6.png


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PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?

試劑:
模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產物;
設備:
PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗:

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成,每個循環包括以下3個步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性:

在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化:

1、變性溫度和時間:

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高,產物特異性越高。復性溫度越低,產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間,可根據待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后,PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后,PCR產物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多,非特異擴增增加。

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