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細(xì)胞冷凍實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù):98 更新時(shí)間:2024-12-03

       細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過(guò)程中,在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi),而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng),它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中,溫度達(dá)-196℃,理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。

一、實(shí)驗(yàn)原理:

隨著溫度降低,細(xì)胞內(nèi)的酶活性會(huì)逐漸降低,到-70℃左右,酶活性幾乎為0,代謝活動(dòng)停止,可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存。然而,隨著溫度降低,細(xì)胞內(nèi)外的水分也會(huì)“結(jié)冰"并形成冰晶,冰晶能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等,能引起細(xì)胞死亡。因此常加入冷凍保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜(DMSO)。DMSO能快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,降低冰點(diǎn),延緩凍存過(guò)程,同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性,提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 制備凍存液,凍存液比例:本實(shí)驗(yàn)室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO,不同實(shí)驗(yàn)室及不同細(xì)胞可能略有差異,也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO;

2. 取形態(tài)良好,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,對(duì)其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計(jì)數(shù);

3. 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入對(duì)應(yīng)的凍存液,使細(xì)胞密度維持在300-500w/mL;

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋,每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液,擰緊蓋管,做好標(biāo)記。

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過(guò)夜;

6. 若沒有程序降溫盒,則按下列順序依次降溫:室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過(guò)夜,注意轉(zhuǎn)移過(guò)程中要保冷,避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化;

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存。

三、注意事項(xiàng):

1. 為保持細(xì)胞最大存活率,一般都采用慢凍存融的方法。

2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為-1℃~12℃/分鐘,當(dāng)溫度下降達(dá)-25℃時(shí),下降速度可增至-5~-10℃/分鐘,到-100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度,過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢則促冰晶形成。

3. 初次凍存者在下降凍存時(shí),宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置,然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法,以觀測(cè)下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系,當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后,僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。

4. 各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣;上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些,骨髓干細(xì)胞-2~-3℃/分鐘合適;胚胎細(xì)胞耐受性較小,不宜太快。總之在一開始時(shí),下降速度不能超過(guò)-10℃/分鐘。

5. 用什么防護(hù)劑合適和用量多大,要依細(xì)胞而定,初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO 較好,一般細(xì)胞可用甘油;用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6. 原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年,但為妥善起見,凍存一年后,應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次,然后再繼續(xù)凍存。

7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),要做好防護(hù)工作,以免凍傷

8. 注意自身的安全,對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過(guò)程中,應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生,小心有毒性試劑例如DMSO,并避免尖銳物品傷人等。